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操作方法：以 6 孔板转染 293T 细胞为例
（初次使用 PEI 进行不同基因转染时应先做预试，优化出适合自己实验的最 佳 PEI 和 DNA 的比例。）

转染前准备：

1. 转染前一天:用胶原酶消化细胞并计数(不建议用胰酶)。按照每孔2x106的细胞量接种 293T至6孔板(每孔加入2ml新鲜的 DMEM:F12+5%FBS wan全培养基和1ml的细胞悬液)置于 37°颁，5%C02，培养箱培养24h。

2. 24h后，移除之前培养基，每孔加入2ml 新鲜的 DMEM:F12+5%FBS。
注意:确保 293T 细胞生长状态良好传代不超过 15 代。

转染流程：
1. 第一天: 显微镜下检查细胞汇合度，当细胞达到 70%到 80%的汇合度时，开始准备转染。
2. 对于每孔细胞，用 100μL无血清培养基（如 OPTI-MEMI培养基）稀释 DNA 使 DNA 终浓度为 1ug/ml（DNA/总培养体积）。

3. 对于每孔细胞，用 100μL无血清培养基(如 OPTI-MEM I培养基)稀释适当比例的适量24765-1。DNA:PEI的比例要依据自己实验摸索最适比例。
4. 将稀释的 24765-1转染试剂加入到稀释的质粒中(总体积 200μL)轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。

4. 小心地将 PEI-DNA 复合物滴加到细胞培养板每个孔中，轻轻摇动培养板混匀。注意加入混合液时轻轻沿着孔板边缘滴入，而不是在细胞的顶部以免破坏细胞的粘附性。
6. 将培养板放入 37°C，5%C02,培养箱培养中培养 24h。

观察结果：
第二天，在荧光显微镜下观察细胞转染效率，通常超过 80%的 293T 细胞在转染后的 24h可以观察到绿色荧光。

注意：
√ 建议进行不同基因转染时应对 PEI 和 DNA 的比例进行优化，以达到最适比例，通常 筛选范围在 1:1 到 5:1 之间。

√ 通常情况下，分别准备 PEI 和 DNA 转染溶液时其体积一般是转染前每孔细胞培养液 体积总量的 1/10-1/20，如细胞培养液体积为 3ml，则稀释 PEI 及 DNA 的体积为 150ul 。质粒 DNA 的浓度通常为 1ug/ml（DNA 质量/细胞培养总体积）。

√ 不同质粒种类以及大小会影响转染效率，如较大片段插入质粒可能转染效率低，可根据 实际实验需要调整，如适当增加转染质粒总量等。

√ HEK293 GnTI 细胞重悬浮可用枪头或移液管反复吹打，但 CHO-S 细胞的粘附性比较强，重悬浮时需要借助细胞刮刀。

√ 一般建议用胶原酶消化细胞，如果表达的是膜蛋白，胰酶消化细胞可能会降低蛋白表达， 建议用胶原酶消化细胞。
√ 对于贴壁性低的细胞系，可用明胶或鼠尾胶铺板，增加细胞与培养皿之间的粘附性。

√ 一旦确定了细胞类型、培养基和 PEI 与 DNA 的最佳比例，就可以在转染后 24 至 96 小时内多次观察转染效率，以优化最大表达量时间点。

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