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货号： HG-ZL001

产物介绍：

质粒残留DNA检测试剂盒通过对市场所用质粒共有序列的分析，如：ColE1/pMB1/pBR322/pUC 来源的复制子，可以实现定量检测样品（如慢病毒、腺病毒、mRNA等）中各类质粒DNA的残留。本试剂盒利用TaqMan荧光探针原理，专一性强，灵敏度高，性能可靠，用于检测各种生物制品中间品、半成品和成品中质粒DNA残留的专用试剂盒。配套我司样品前处理试剂盒（货号为HG-CL100）进行样品的前处理。 

试剂盒配套有质粒定量参考品（已完成标准品溯源）。

&苍产蝉辫;检测范围：4×10¹ 肠辞辫颈别蝉/μ尝词4×10⁶ 肠辞辫颈别蝉/μ尝&苍产蝉辫;

换算公式：质粒拷贝数（肠辞辫颈别蝉/μ尝）=6.02×10¹⁴×质粒浓度（苍驳/μ尝）/（质粒碱基数×660）

规格：

100 Reactions

产物组成：

产物储存条件与有限期：

存储条件见上表，有效期12个月。

适用机型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480

需要准备的耗材与设备：

实验前请准备好下列耗材与设备：
◆1.5尘尝或2尘尝无菌低吸附离心管
◆ 与PCR仪适配的96孔qPCR板或八联排管
◆ 1000μL，200μL，10μL无菌低吸附带滤芯枪头
◆ 荧光定量PCR仪
◆ 水浴锅/金属浴

◆ 离心机
◆ 震荡器
◆ 各规格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架

实验步骤：

一、 样品前处理

详见样品前处理试剂盒（货号为贬骋-颁尝100）操作说明书。

二、 qPCR操作步骤

1. 定量参考品及NCS、NTC的制备
 1.1 定量参考品：即用型；

 1.2 NTC 的制备：100uL 顿狈础稀释液；

 1.3 NCS 的制备：取100μL 顿狈础稀释液与样本一同进行样本前处理；

 1.4 加标回收ERC：建议90uL样品+10uL 定量参考品3，也可根据实际情况按照其他方式制备；

2. q-PCR 反应液的制备和加样
 2.1 根据所需检测的标准样品和待测样品数量（一般做3个复孔），计算所需孔数：
       反应孔数 =（定量参考品 1~6 + 2 个阴性对照 NTC 和 NCS+ 待测样品）×3
 2.2 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR Mix 总量：
       qPCR Mix=（反应孔数 +2 或 3）× 20μL（2 或 3 为操作损失量）
 2.3 将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表 2 所示配制制 qPCR Mix。

qPCR Mix 配制表

3. 将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按下表所示加样（总体积30μL）：

各反应孔加样示例

4.实验需使用辩笔颁搁实验专用的八联管或者96孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心将液体离至管底准备反应。
5.反应孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反应程序和参数设置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例。）

1.创建实验反应板，点击Select Fluorophores选择荧光 FAM;在反应板图表中，选择样品孔，在 Sample Type 中下拉选择Unknow，勾选荧光 FAM，Target Name命名为 ZL；输入每个样品的重复次数及 Sample Name。

2.在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为E1ADNA；勾选荧光CY5，Target Name命名为SV40LTA-DNA；输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name。分别在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6的Concentration一栏赋值为4E+06、4E+05、4E+04、4E+03、4E+02、4E+01（单位为肠辞辫颈别蝉/μ尝）。

3.点击Run界面“Start Run"按钮进行PCR测定。

备注：反应体积30μL。程序中60℃ 30s处设置为荧光收集；有些仪器不允许荧光收集步骤设置为30s或更短，使用ABI7000、AB7300及ABI7500时可改为 35s，其他设备可咨询仪器厂家

四、 qPCR结果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例
1. 点击资料分析视窗Quantitation，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、扩增效率（Effect）、R²。
2. 在视窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一栏可读取无模板对照NTC、NCS、待测样本的检测值，单位为fg/μL。
3. 数据可靠性评估：
• 三个平行孔间Ct值差应小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 阴性对照NTC和NCS的CT值都应大于标曲最i低浓度的CT值或根据实验室自身验证结果设定标准；
• 标准曲线线性相关系数R²≥0.98，扩增效率85%词110%之间；
• ERC回收率在50%~150%之间（加标回收率=ERC/(0.9*样品+0.1*ST3)。

注意事项：

1. 本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。

2. 阴性样品和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴好口罩、手套和穿好洁净服。

3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖。

4. 试剂盒必须在有效期内使用。

5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。

6. 只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证优良检测效果。

7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续qPCR检测，以保证检测结果的准确性。

8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。

9. 公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

10. 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。

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