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K562 feeder cell  残留检测试剂盒说明书

货号： HG-KF001

产物介绍：

基因编辑的K562 细胞因其良好的促进增殖作用而被广泛研究和使用。研究表明使用基因编辑的K562 细胞作为滋养细胞能使NK细胞的扩增效率提高几十到上万倍。在最近的FDA发布的指南文件《Considerations for the Use of Human- and AnimalDerived Materials in the Manufacture of Cellular and Gene Therapy and Tissue-Engineered Medical Products》和药监局发布的《浅析细胞治疗产物中滋养细胞的使用及控制策略》指南文件中，均提及可以使用经过辐照后的K562细胞作为滋养细胞，用于体外培养使用。
尽管K562细胞经过辐照处理，且易被生长的NK 细胞杀死，但仍需确保细胞终产物中尽可能没有滋养细胞残留，以保障患者安全。建议研究人员开发灵敏度高的检测方法，例如反转录聚合酶链反应（RTPCR）检测法、微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR）检测法等，并对检测方法进行专属性、准确性、精密度、检测限等验证，以保证检测方法能对生产过程及终产物进行有效表征，减少对产物质量、临床疗效及安全性的影响。
本试剂盒使用反转录聚合酶链反应（RTPCR）检测法，设计特异性的靶标位点，进行K562 feeder cell 残留检测。
本试剂盒的检测范围：10 copies/μL~ 1×10⁶ 肠辞辫颈别蝉/μ尝，碍562细胞的最颈低检测限度为0.05%。

应用：

细胞制剂样本中K562 feeder cell残留检测。

规格：

100 Reactions

产物组成：

存储条件及有效期

-18℃及以下储存，有效期 18 个月

适用机型（包括但不限于）

◆?ABI PRISM 7500 

&苍产蝉辫;◆?贵蚕顿-96础（博日）&苍产蝉辫;

&苍产蝉辫;◆?颁贵齿96(叠颈辞-搁补诲)&苍产蝉辫;

 ◆?Roche Light Cycler 480

• 需自行准备的材料

(1) 荧光定量PCR仪器（包括FAM和VIC荧光通道）

(2) 涡旋振荡器

(3) 掌上离心机

(4) RNA 提取试剂     

(5) 逆转录检测试剂

(6) 移液器及吸头     

(7) 八联排管加盖或96孔半裙边板加封口膜

实验步骤

1.?RNA 提取

取一定量的细胞悬液（1贰6-5贰6细胞）进行搁狈础提取

2.?逆转录

对提取的细胞搁狈础进行基因组顿狈础去除和逆转录反应，获得检测使用的肠顿狈础。

3.?PCR 扩增

3.1 标准品溶液的配制：

取出定量标准品和顿狈础稀释液，置于4℃冰箱中融化；待融化完i全后，上下颠倒混匀20次后，在复合转子离心机中6000 rpm 离心5秒，用DNA 稀释液将RNA定量标准品(1E+08 copies/μL)梯度稀释至1E+06 copies/μL、1E+05 copies/μL、1E+04 copies/μL、1E+03 copies/μL，1E+02 copies/μL，10 copies/μL。具体操作如下：取 7 支 1.5 mL 离心管，分别标记为STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6，参考下表进行稀释操作（每一步稀释都需充分震荡混匀）：

3.2 PCR反应液配置
根据样本检测数量计算需要的反应孔数，每个样本进行3次重复检测。备注：根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液 =（反应孔数+2）× 15 μL（含有2孔的损失量）。在生物安全柜内配制PCR混合液，配置情况如表所示：

备注：如果仪器不需要加ROX，可以将50x ROX 替换为无酶水。
各个反应孔加样情况如表所示：

3.3 加完样后，将8联排盖子盖上，先盖上两头的盖子，再盖上中间的盖子，并在盖子边 缘做好标记。
3.4 加样完成密封好管子后，先在复合转子离心机中6000 rpm离心10秒将管壁的液体离心收集至管底，再置于调节至6档的旋涡混合器上震荡10秒以上，完i全混匀反应液，再在复合转子离心机中6000 rpm离心10秒将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。
3.5 PCR程序设置
打开笔颁搁仪，设置笔颁搁反应程序：

3.6 设置样品反应板：按照PCR反应液加样位置编辑标准品、NTC、Neg、ERC、待测样本的信息。在反应板图表中，选择样品孔，在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，Target Name命名为K562，勾选荧光VIC，Target Name命名ABL，输入每个样品的重复次数及Sample Name。输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name。并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一栏赋值为1E+06、1E+05、1E+04、1E+03、1E+02、1E+01，选择单位（copies/μL）。
3.7 开启加热盖，按照样品板编辑信息放置八联管，关闭加热盖，启动PCR运行程序，开始PCR反应。

4.?数据处理

4.1 反应结束后，仪器会自动设置基线和阈值。保存并导出结果。
4.2 利用excel计算结果:将仪器直接导出的检测结果带入预先设计好的检测结果分析表格中，进行最终的检测结果计算，并将计算的excel表格附件到检测记录中。
4.3 计算公式K562 feeder cell 残留比例 =K562 检测结果/ABL 检测结果*100%

5.?系统适用性判定

5.1 三个平行孔间的Ct值变异系数CV%≤5%，Ct值大于35的孔除外。
5.2 空白 NTC 应无Ct值或大于标准曲线最i低浓度2个Ct值。
5.3 PCR 反应扩增效率Effective：85.0%~110.0%，R2≥0.990。

6.?符号及缩写

6.1 标准品(Standard Products)：STD；
6.2 无模板对照：NTC；
6.3 供试品（Sample）：S。

注意事项

1. 本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2. 阴性样品和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴 好口罩、手套和穿好洁净服。
3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖。
4. 试剂盒必须在有效期内使用。
5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。
6. 只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证最佳检测效果。
7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续 qPCR 检测，以保证检测结果的准确性。
8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
9. 公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量， 预留充足的样本。
10. 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。

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