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支原体顿狈础检测试剂盒（辩笔颁搁-荧光探针法）说明书

货号： HG-ZY002

产物介绍：

支原体顿狈础检测试剂盒可用于定性检测主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞中是否存在支原体污染。本试剂盒利用荧光探针法辩笔颁搁技术，参照贰笔2.6.7和闯笔齿痴滨滨支原体检测相关要求进行验证，可覆盖100多种支原体，且与密切相关的菌种无交叉反应，检测快速，在2丑内可完成检测工作，专一性强。

规格：

50 Reactions

产物组成：

操作方法：

一、准备工作

• 试剂盒准备

将试剂盒各组分置于冰上或4℃，确保充分溶解开始操作。

• 需自备的耗材及设备

1. 荧光定量笔颁搁仪、涡旋仪、离心机

2. 高精度移液器及一次性无菌无酶低吸附带滤芯吸头（0.1-2.5 µL、0.5-10 µL、10-100 µL、20-200 µL、100-1000 µL）

3. 1.5 mL 无菌无酶低吸附离心管

4. 无菌无酶八联管或96孔辩笔颁搁板
   

二、操作流程

• 操作详细步骤

1、待测样本的提取：

建议使用谱新生物“支原体DNA样本前处理试剂盒（HG-CL200）"提取样本DNA。在加入样本的同时，加入4 μL的内控（Internal Control）。提取样本时，建议同步提取顿狈础稀释液作为阴性对照。

2、qPCR 反应液的制备：

2.1 根据所需检测的参考品和待测样品数量（一般做2-3组复孔），计算反应所需孔数：反应孔数=（1个无模板对照NTC+1个阳性对照PC+待测样品）×复孔数 

2.2 根据反应孔数计算本次所需的qPCR MIX总量：qPCR MIX =（ 反 应 孔 数 +2 或 3）×12.5 μL（2×qPCR Reaction MIX）+（ 反 应 孔 数 +2 或 3）×2.1 μL（ 支 原 体 Primer&Probe MIX）+（反应孔数+2或3）×0.4 μL（Internal Control）（2 或3为操作损失量） 

2.3 将所用试剂置于冰上完i全溶解，轻微振荡混匀，瞬时离心，按下表所示配制：

【注】:如果在提取时已加入内控，则配制qPCR MIX时，用等体积的顿狈础稀释液代替。

2.4 将配制的qPCR MIX，轻微振荡混匀，瞬时离心，按15 μL/孔分装至八联管或者96孔板中。
2.5 将 DNA 稀释液按10 μL/孔加到分装了qPCR MIX八联管或者96孔板中。
已融化未使用的DNA 稀释液可在2-8℃短暂保存，若长期不使用，请储存于-20℃。

3、qPCR 加样：

3.1 将所需试剂置于冰上操作，轻微振荡混匀，瞬时离心，加样（总体积25 μL）：

3. 2 实验可使用无菌无酶的八联管或者96孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心至管底准备反应。

笔颁搁程序设置

支原体检测荧光基团选择贵础惭，淬灭基团为狈辞苍别，内控荧光基团选择颁驰5，淬灭基团为狈辞苍别，参比荧光为搁翱齿（根据仪器要求选择）。
反应程序：

程序中58℃ 34 s处设置为荧光收集；反应体积25 μL。

结果分析

注意事项

1、本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2、阴性样品（2×qPCR Reaction MIX、Primer&Probe MIX 和 顿狈础稀释液等）和阳性样品（PC和待测样品等）的配制和加样环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴好口罩、手套和穿好洁净服。
3、注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖，使用移液器移液时，需避免液体挂壁。
4、试剂盒必须在有效期内使用，不建议不同批次的相关试剂混用。
5、试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用，且需确保其充分溶解，各组分使用前需充分混匀，以保证试剂的均一性，经混匀的试剂需经短暂离心，以使管壁及盖子上的液体全部集中于管底。若发现顿狈础稀释液中有析出物，建议于 37 ℃条件下进行孵育，使顿狈础稀释液完i全溶解。
6、只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证最佳检测效果。
7、最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
8、公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。
9、本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。

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